2x miRNAUniversal SYBR qPCR Mix (莖環(huán)法)

miRNA反轉(zhuǎn)錄/熒光定量檢測試劑盒 

目錄號:71501

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件

-20℃保存，有效期 24 個月。

使用前，充分融解，輕輕顛倒混勻，短期使用可放在 4 ℃，避免反復凍融。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

產(chǎn)品簡介

2x miRNA Universal SYBR qPCR Mix（莖環(huán)法）是專門為莖環(huán)法miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑，其中的DNA polymerase 采用的是抗體修飾的熱啟動形式， 配合特殊的Buffer 體系，使反應特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進行準確定量。

預混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，使用qPCR Mix時不需要額外添加ROX來校正儀器。

需要自備的試劑：

待檢測miRNA對應的qPCR的引物

Realtime 上游引物設計：

miRNA序列除去3’端6個堿基 的剩余部分作為上游引物，如miR-1的上游引物為(注意 把U改為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢查引物的Tm 值（一般參考DNAMAN），如果Tm值較低，則在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可設計 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物設計好后，需要通過預試驗檢測引物的特異性。一般需要做溶解曲線來檢測引物的特異性；同時最好將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測產(chǎn)物是否單一（產(chǎn)物長度很短，需要3%以上的瓊脂糖膠）

操作步驟：

1. 在室溫融化2x miRNA qPCR Mix、primer（10μM）、DNA模板、ddH2O，并置于冰上備用。

2. 冰上配制qPCR反應體系：（以20μl反應體系為例）

1） 推薦模板加樣量為1-2μl / 20μl反應體系，cDNA原液≤總反應體系的10%。

2） 對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA 模板易導致非特異性擴增，根據(jù)所檢測miRNA 的豐度適當?shù)南♂宑DNA（10倍或者100倍）。

3） 通常推薦引物濃度為0.2 μM，就可以得到較好的結果，反應效果不佳時可在0.1 - 1.0 μM范圍內(nèi)進行調(diào)整。

擴增效率不高的情況下，可提高引物濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。

3. qPCR反應程序

注意：

1） 本產(chǎn)品兼容性強，絕大多數(shù)情況下使用二步法和三步法均可獲得良好效果。一般來說，二步法擴增特異性高，三步法擴增效率高。如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴增或提高退火溫度；如果因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試加長延伸時間或者進行三步法PCR擴增。

2） 根據(jù)引物的Tm值進行退火&延伸（退火）溫度的設定；

3） 延伸（退火&延伸）時間的設置還需要根據(jù)您所使用的qPCR儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整。

4） 融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設定。

miRNA反轉(zhuǎn)錄/熒光定量檢測試劑盒